Химики и биологи Санкт-Петербургского университета разработали новые реагенты на основе гетероциклоалкинов, которые позволят надежно и безопасно присоединять флуоресцентные метки к биомолекулам. Созданные вещества помогут визуализировать процессы, протекающие в клетках и тканях живых организмов, и изучать их динамику в режиме реального времени.
Применение циклононина, содержащего зеленую флуоресцентную метку, для модификации и визуализации при помощи флуоресцентной микроскопии азидогликанов (А) и азидо-ДНК (B) раковых клеток HEK293
© Пресс-служба СПбГУ
Современные ученые могут исследовать состав и изменение живых клеток с помощью флуоресцентного биоимиджинга. Это метод, при котором интересующие исследователя молекулы организма, например белки или ДНК, «подсвечиваются» флуоресцентными красителями и под воздействием света определенной длины волны становятся видимыми для скрининговых систем.
Чтобы биоимиджинг был успешным, необходимо надежно «сшить» флуоресцентные метки и выбранные молекулы. Для этого используют специальные химические реакции. По словам кандидата химических наук доцента кафедры органической химии СПбГУ Натальи Данилкиной, самыми востребованными и сбалансированными сегодня являются реакции SPAAC (strain-promoted azide-alkyne cycloaddition). Они позволяют непосредственно в клетках присоединять к биополимерным молекулам, модифицированным азидными группами, специальные реагенты — циклоалкины, содержащие метку с красителем.
«SPAAC — это биортогональная клик-реакция, то есть реакция, которая способна протекать в живых клетках, но при этом не вредит им и сама не подвержена влиянию со стороны живых систем, — объясняет исследователь. — В таких реакциях не требуется использовать токсичные медные катализаторы, в них отсутствуют побочные продукты. Реакции SPAAC чрезвычайно важны для того, чтобы проводить биологические эксперименты. Таким образом можно изучать физиологию живых клеток и процессы, которые в них протекают, а также устанавливать склонность клеток к преобразованию в опухолевые».
Как отмечает Наталья Данилкина, на рынке уже существует несколько видов реагентов на основе циклоалкинов — молекул, имеющих замкнутый цикл из атомов углерода с тройной углерод-углеродной связью внутри цикла. Однако ученым СПбГУ под руководством доктора химических наук директора Института химии Ирины Баловой удалось синтезировать принципиально новые реагенты. Они отличаются легкодоступностью и оптимальным балансом между реакционной способностью в SPAAC и стабильностью, то есть устойчивостью к окружающей среде и прочим реагентам.
Работа над веществами проходила в несколько этапов. Вначале исследователи создали специальный синтетический метод для получения циклоалкинов. Он позволил легко сконструировать и синтезировать серию молекул с разным размером цикла (от восьми до десяти атомов) и специальными структурными элементами — гетероциклическим кольцом и гетероатомом (любым атомом, кроме углерода или водорода) в циклоалкине. Эти элементы были важны для регулировки баланса между активностью в SPAAC и стабильностью.
Следом химики СПбГУ изучили реакционную способность и устойчивость синтезированных соединений с помощью кинетических исследований и квантовых химических расчетов. Работы проводились на базе Научного парка СПбГУ: в Вычислительном центре, а также в ресурсных центрах «Методы анализа состава вещества», «Магнитно-резонансные методы исследования» и «Рентгенодифракционные методы исследования».
По словам Натальи Данилкиной, эксперименты и расчеты помогли выявить неклассическую реакционную способность соединений с циклами из девяти атомов. «Обычно чем больше цикл, тем меньше реакционная способность и больше стабильность соединений. В нашем случае стабильность действительно отличалась: с восьмичленными циклами было невозможно работать из-за их неустойчивости, а девятичленные оказались стабильными. А вот реакционная способность восьмичленных и девятичленных циклов при этом была практически одинаковой», — поясняет исследовательница.
На основе этих данных ученые СПбГУ установили, что гетероцикл-содержащие гетероциклоалкины из девяти атомов (циклононины) — самая подходящая группа реагентов для SPAAC. Как рассказала Наталья Данилкина, у этих соединений наблюдается наилучший баланс между стабильностью и реакционной способностью. Тогда как соединения с циклами из восьми атомов (циклооктины) оказались слишком нестабильными, а вещества из десяти атомов (циклодецины) инертными.
На последнем этапе исследователи СПбГУ разработали метод присоединения флуоресцентных красителей к новой группе реагентов и провели эксперименты по введению получившихся соединений в биомолекулы раковых клеток. Исследования проходили в лаборатории биомедицинской химии СПбГУ. Эксперименты подтвердили эффективность циклоалкинов с девятичленным циклом для SPAAC. Как сообщила Наталья Данилкина, ученые СПбГУ уже могут использовать новые реагенты для проведения исследований по различным направлениям.
В настоящее время научная группа работает над усовершенствованием полученных веществ. «Сейчас для того, чтобы в клетке прошла реакция с использованием наших реагентов, требуется восемь часов. Мы стремимся довести эту реакционную способность до 15 минут. Проверяем все возможные варианты структур с улучшенной реакционной способностью при сохранении стабильности. Ищем наиболее эффективную молекулу. Также подбираем оптимальные пути связывания реагентов с флуоресцентными красителями и другими группами», — заключает Наталья Данилкина. Она добавляет, что в дальнейшем исследователи планируют запатентовать разработку.
«Наша работа полностью отвечает приоритетным направлениям Программы научно-технологического развития Российской Федерации и Программы развития СПбГУ, которые связаны с переходом к персонализированной медицине и высокотехнологичному здравоохранению. Молекулы, которые мы придумываем и синтезируем, являются молекулярными инструментами для биологов и медиков. Они позволяют им исследовать молекулярные механизмы заболеваний и находить эффективные методы их лечения», — отметила руководитель исследовательской группы, директор Института химии СПбГУ доктор химических наук, профессор Ирина Балова.
Исследование было поддержано грантом РФФИ № 20-03-00117 и грантами РНФ 21-13-00218, 19-73-10077.
Статья опубликована в журнале Journal of the American Chemical Society
Источник: Пресс-служба СПбГУ
