Американские ученые придумали новый способ увидеть расположение молекул РНК в клетке. Они пометили молекулами ДНК нити разных РНК, распределенные по всей клетке, а затем секвенировали ее геном, чтобы затем по этим данным построить изображение. Получившиеся снимки по детальности не уступают результатам световой микроскопии, а также открывают перед учеными новые возможности: прежде столь подробное изображение «генетических внутренностей» клетки разглядеть за раз они не могли.
В — фото клеток, производящих красный и зеленый флуоресцентные белки, в обычный микроскоп. D — результат ДНК-микроскопии. Красный и зеленый — флуоресцентные белки, серый — актин, белый — белок, участвующий в расщеплении глюкозы
© Weinstein et al. / Cell
Современные методы микроскопии хорошо определяют форму клеток и плотность расположения молекул внутри них, но не позволяют распознать отдельные молекулы. Можно, конечно, ввести в клетку специальные красители или светящиеся зонды, но для каждой интересующей ученых молекулы нужен свой зонд, желательно, не перекрывающийся по спектру излучения с другими. Эти технологии работают для отдельных белков, но становятся неудобны, когда речь идет о нуклеиновых кислотах, например, молекулах РНК.
РНК представляют собой копии ДНК, «выписки» из генов, смотря на которые, клетка синтезирует белки. В отличие от ДНК, которая сконцентрирована в ядре, РНК распределены по всей цитоплазме, а иногда группируются в том месте, где необходимы кодируемые ими белки. Чтобы рассмотреть расположение молекул РНК в клетке, группа Джанга Фэна (человека, который впервые заставил работать CRISPR/Cas в клетках человека) из Массачусетского технологического института создала метод ДНК-микроскопии. Впрочем, с привычной нам микроскопией он имеет мало общего: например, для него нужен не микроскоп, а секвенатор и специальный алгоритм, который строит по данным секвенирования картинку.
Для начала интересующие нас клетки фиксируют и проделывают в мембране небольшие дырочки. В эти отверстия впрыскивают полимеразы, ферменты для копирования нуклеиновых кислот и ДНК-зонды: последовательности ДНК, комплементарные (то есть способные прилипнуть) к исследуемым молекулам РНК и несущие на конце уникальные метки.
В качестве точки отсчета — условно говоря, «нулевой координаты»— ученые использовали РНК белка актина. Этих РНК много в самых разных участках клетки, поэтому логично было ожидать, что от них можно будет дотянуться до любой точки клетки.
Впрыснутые в клетку зонды прилипают ко всем РНК, и клетка достраивает зонды до конца — для этого ей, собственно, и требуются полимеразы. Получаются нити, в которых за последовательностью РНК следует уникальная метка. Затем в клетки вбрасывают праймеры — набор коротких уникальных кусочков ДНК. Они прилипают на концы нитей, клетка тоже достраивает их до конца. Получаются молекулы, состоящие из последовательности РНК, уникальной метки и праймера.
Затем эти молекулы слипаются друг с другом своими концами, поскольку праймеры комплементарны. Итогом становится длинная нить: «нулевая» РНК, уникальная метка 1, слипшиеся праймеры, РНК-мишень, уникальная метка 2. Чем ближе друг к другу в клетке расположены «нулевая» РНК и РНК-мишень, тем больше получится таких нитей, и, соответственно, по их числу можно оценить расстояние между двумя фрагментами РНК.
Наконец, исследователи секвенируют нуклеиновые нити из клетки и оценивают их концентрацию. По соотношению сцепок «нулевых» РНК с разными РНК-мишенями компьютерный алгоритм восстанавливает их распределение по клетке и даже ее форму. Изображения, которые исследователи получили таким методом, очень напоминают результаты обычной световой микроскопии.
В будущем они надеются изучать, как распределены РНК в нервных и иммунных клетках (для которых важно взаимодействовать разными своими частями с другими клетками), а также определять уникальные последовательности РНК с точечными мутациями в иммунных и раковых клетках.
Статья опубликована в журнале Cell
Источник: chrdk.ru
