Холерный CRISPR/Cas нашел и сам заменил целевой ген в кишечной палочке

Американские ученые обнаружили у холерного вибриона мобильный генетический элемент, передвигающийся с помощью системы CRISPR/Cas. На его основе они создали систему генетического редактирования, которая умеет делать то, чего не могут классические «молекулярные ножницы» — встраивать последовательность ДНК в нужную часть генома.

Система CRISPR/Cas9 © artofthecell.comСистема CRISPR/Cas9
© artofthecell.com

В 2012 году Дженнифер Дудна и Эммануэль Шарпентье описали механизм работы системы CRISPR/Cas9 у бактерий и впервые предложили использовать ее для редактирования генома. С тех пор молекулярные биологи по всему миру применяют эти генетические ножницы на любых живых организмах и рассчитывают разработать методы генной терапии для человека (и усовершенствовать технологию редактирования генома зародышей). Однако протоколы с использованием CRISPR/Cas9 пока не вышли за пределы клинических испытаний, и причиной тому — технические особенности системы.

Первый недостаток состоит в ее неточности: CRISPR/Cas9 может атаковать не только свою цель, но и другие участки ДНК, похожие на целевые. При этом из генома могут исчезнуть жизненно необходимые области. Второй недостаток — в ненадежности: CRISPR/Cas9 разрезает обе нити ДНК, но не обеспечивает их соединение обратно. Предполагается, что этим займутся клеточные системы репарации (ремонта) ДНК, однако сам «криспр» никак это не контролирует.

Наконец, CRISPR/Cas9 позволяет только вырезать часть ДНК, но не вставить, поэтому эту систему можно применять для лечения далеко не всех генетических дефектов.

Единственный выход — ввести в клетку плазмиду, то есть кольцевую молекулу ДНК, несущую нужную нам последовательность, и надеяться, что система репарации воспользуется для починки разрыва материалом из плазмиды. Однако, как показывают эксперименты, клетка не всегда «догадывается», чего от нее требуют, и эффективность такого встраивания не очень высока — например, первый в истории эксперимент по целевой замене дефектного гена в эмбрионе человека, предпринятый в 2015 году, окончился успехом лишь в 4 из 86 случаев.

Группа Сэмюэля Штернберга, бывшего коллеги Дженнифер Дудны, предложила альтернативу CRISPR/Cas9. По их собственному признанию, они вдохновились результатами коллектива биоинформатика Евгения Кунина, который в 2017 году обнаружил новый вариант системы CRISPR/Cas в составе бактериального транспозона.

Транспозон — это мобильный генетический элемент, участок ДНК, который способен перемещаться по геному. Транспозон кодирует белки, которые вырезают его из одного места расположения и встраивают в другое. Транспозоны встраиваются либо в случайно выбранное место генома, либо в одно, строго определенное.

Группа Кунина обнаружила у бактерий транспозоны, содержащие в себе элементы CRISPR/Cas, и предположила, что мобильные элементы используют эту систему для встраивания в конкретный участок ДНК: гены Cas кодируют белки, ответственные за встраивание, а области CRISPR — наводятся на последовательность, в области которой оно произойдет.

Штернберг с коллегами проверил это предположение. Они взяли транспозон Tn6677, выделенный из ДНК холерного вибриона, и испытали его на клетках кишечной палочки. Исследователи встроили в транспозон участки CRISPR, задающие определенное место в геноме кишечной палочки, заразили ее клетки транспозоном и продемонстрировали, что мобильный элемент встроился именно в то место, которое они ему предназначили.

Таким же образом им удалось встроить в геном кишечной палочки и полезную нагрузку — искусственную последовательность ДНК, обрамленную концевыми участками транспозона. В клетку вводились транспозоны без «хвостов», нацеленные на конкретный ген, и «грузы» (с «хвостами»).

Транспозоны искали цель, хватались за «хвостатый груз» и встраивали его в геном бактерии в нужном месте.

Затем исследователи создали ряд мутантных транспозонов, лишенных разных элементов системы CRISPR/Cas, но все они оказались неактивны. Это окончательно подтвердило роль CRISPR/Cas в их миграции.

Таким образом, новая система способна на то, что не умеют классические «молекулярные ножницы» — встраивать в ДНК новую последовательность. При этом она сама «убирает за собой», не оставляя в ДНК щелей и надежно «сшивая» транспозон (или имитирующий его «груз») с концами разрыва ДНК.

Затем настало время выяснить, насколько «транспозонный криспр» превосходит традиционный CRISPR/Cas9 по точности. Для этого ученые нацелили систему на 16 мест в геноме кишечной палочки, и та попала в цель примерно в 95% случаев. Это существенно превосходит меткость классических «молекулярных ножниц» — например, в экспериментах российской группы, занимающейся генетическим редактированием эмбрионов человека, лишь 50% зародышей не несут в себе ошибок (отсутствия разрывов или, наоборот, лишних поломок).

Новая система прицельной доставки генетического груза выглядит хорошей основой для терапевтических разработок, хотя ее еще предстоит, конечно, проверить на клетках животных и человека и лишь затем — на целых организмах.

Источник: chrdk.ru

Метки , , , . Закладка постоянная ссылка.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *